التقانة الحيوية

النشاط الخامس

التقانة الحيوية

حفظ النشاط

في احد أفلام ديزني لاند الشهيرة كان هناك تلميذ كسول قام بسحر مكنسته لتقوم بجميع أعماله القذرة، ففي البداية كان كل شيء يسير على ما يرام وكان التلميذ يأخذ الأمور ببساطة، منبهرا بنفسه، وفي نفس الوقت كانت المكنسة تقوم بجميع الأعمال الصعبة عنه ولكن فيما بعد بدأت المكنسة تخرج عن السيطرة إلى أن وجد نفسه واقعا بالكثير من المشاكل. في احد المختبرات كان هناك متدرب للتقانه الحيوية وكان هذا المتدرب يفكر في نفسة قائلا لقد فشلت بسحب مغزى هذه القصة. ففي اليوم الأول من الاسبوع الأول الذي بدأت العمل به وجدت نفسي أحلم بطريقة سحرية تمكن أنابيب الاختبار من أن تملا نفسها بنفسها بالمحلول الذي طلبه مني البروفيسور لكن سرعان ما تبددت أحلامي حينما شعرت بضربة خفيفة على كتفي، وجدت حينها البروفيسور يقدم لي أنبوبا اختبار غير معلمان و أعطاني التعليمات التالية:-

" أنا أعطيك هذان الأنبوبان اللذان يحتويان على البلازميد، كما هو معلوم لديك فإن البلازميدات تكون موجودة بشكل طبيعي على شكل سلاسل دائرية من المادة الوراثيةDNAالتي تحتوي على جينات معينه، و لكن يمكن أن تصنع و تحضر لتتناسب واحتياجات الباحث.

ثم نظر إلى يدي و قال: أنبوب الاختبار الذي بيدك اليمنى يحتوي على البلازميد الاصلى، و هو البلازميد الذي لم تتغير صفاته، على أي حال، أنبوب ألاختبار الذي بيدك اليسرى يحتوي على البلازميد الذي أدخل اليه الجين النادر.

أنا الآن أؤمنك على سرية هذا الجين، و لكن لا أستطيع إخبارك عنه. لذلك أرجو منك تعليم أنابيب الاختبار بطريقة صحيحة لكي لا يحصل اختلاط.

كما أني سوف أعطيك خارطة للجينات المهمة التي يحويها البلازميد مع موقع القطع EcoRΙ و أنزيم القطع (EcoRΙ). هذه الأنزيمات تقطع الDNA في مواقع معينه و لذلك من المهم معرفة تسلسل الDNA على البلازميد و ذلك لمعرفة مكان قطع الأنزيم على الDNA. هذه المواقع تسمى مواقع القطع. البلازميدان يحتويان على جين مقاوم لمضادات البكتيريا أمبيسيلين (ampicillin)، يقوم الامبيسيلين بمنع إحدى الأنزيمات المسئولة عن بناء الجدار الخلوي للبكتيريا من القيام بعملها.

إن البكتيريا التي تحوي على هذا الجين لديها المناعة ضد الامبيسيلين. بالإضافة إلي إن البلازميد يحتوي على جين ينتج أنزيمBGAL و يسمى هذا الجينLacZ. جميع مستعمرات البكتيريا التي تحتوي على أنزيم BGALو المادة المتفاعلة له X-Gal سوف تكون ملونه باللون الأزرق.

أنا قمت بإدخال الجين النادر إلى الجين الذي ينتج إنزيمBGAL . " نعم، نعم حالا" قلت للبروفيسور و ذهبت لإكمال حلمي عن أنابيب الاختبار السحرية، فجأة تذكرت أن البروفيسور طلب مني تحديد أنابيب ألاختبار . و كما أنتك تتوقع لقد نسيت أي أنبوب اختبار يحتوي على الجين النادر و أي أنبوب اختبار يحتوي على البلازميد الأصلي. جلست ضائعا في أفكاري، لا أفكرالا كيف سأطرد من العمل فقط؛ و لكنني أفكر كيف سأعمل في مكان آخر بعد هذه الغلطة الفادحة. فخجلت من نفسي و طأطأت راسي إلى أن رأيت خارطة البلازميد، كادت روحي أن تطير من الفرحة، حينها علمت إنني نجوت.







تمرين:-



حاول أن تصمم تجربتين بحيث تساعداك في التعرف على محتوى كل أنبوب اختبار.



بإمكانك إستخدام أي شيء موجود في هذه التجربة:-

- جل الاجروز (agarose gel ) لتدفق قطع ال .

إيثيديوم برومايد (Ethidium Bromide ).

- أنبوب اختبار فيه أنزيمات التقطيع ( EcoRI)

-بكتيريا الايكولاي (E.coli).

-المادة المتفاعلةX-Gal .

- أطباق من الاغار تحتوي على الامبيسيلين (ampicillin).

- صندوق إنارة فوق البنفسجية(UV ).

- خارطة بلازميد.











جعل الDNA خطي لتسيره على الجل



أنا متأكد أنكم و جدتم أفكارا جميلة لكيفية حل هذه المشكلة. لكن سوف نكمل العمل حسب ما فكر به المتدرب، سوف نستخدم المعلومة التي لدينا و التي تنص بأن البلازميد الواحد طوله 3000 زوج من القواعد و الأخر طوله 5000 زوج من القواعد، سوف نضع الDNA في الجل ثم تقوم بتمرير تيار كهربائي لكي يتحرك الDNA على الجل.

الجل الاجاروزي على المستوى الجزيئي عبارة عن شبكة معقدة من الثقوب بين الخيوط، لهذا فإن الDNA الأكبر حجما سيجد صعوبة بالمرور من بين الثقوب و يكون أبطا في الحركة على الجل، ولذلك فإن الجل سوف يقوم بفصل قطع الDNA حسب حجمها. و بعدها سوف نقوم بصبغ الجل بالاثيديوم بروميد(Ethidium Bromide) الذي يربط بقطع الDNA و يجعلها تظهر بوضوح تحت الإنارة الفوق بنفسجية.

و بجانب قطع الDNA التي نعمل عليها سوف نقوم بوضع قطع من الDNA معروفة الطول، تسمى سلمDNA . و لكي نتأكد أن الDNA قد فصلت حسب الحجم يجب أن نجعلها خطيه. تذكر، إنDNA في أنبوب الاختبار عبارة عن بلازميدات و هي دائرية الشكل للDNA.

و لذلك يجب أن نقطع الDNA في مكان معين لكي نجعلها خطية( مثل قطع الرابطة المطاطية)، سوف نقطع الDNA بإستخدام أنزيمات القطع التي تقوم بقطع البلازميد في موقع معين واحد فقط و في هذه الحالة سوف نستخدم (EcoRI).

رجاءا إقرا المعلومات بحذر وباشر العمل بعد أن تتأكد أنك قد فهمت التجربة جيدا و أن لديك جميع المواد والمعدات المطلوبة على طاولة عملك.

















التحضير:-



1. تأكد من أن درجة حرارة الحوض المائي 37 درجة مئوية، قم بتثبيت الحرارة وانتظر حتى تثبت.

2. عليك القيام باستخدام أداة اسمها الماصة المخبرية الدقيقة، و هذه الأداة تمكننا من قياس كميات صغيرة جدا من السائل حتى أقل من 1 ميكروليتر(1 ميكروليتر = 0.0000001 من اللتر =1 مليون من اللتر) و لكي تتعود على إستخدام هذه الماصة قم بمحاولة قياس كميات مختلفة من المياه المقطرة، و ذلك مع معلمك. بإستخدام الماصة قم بقياس1،100،10،و 1000 ميكوليتر في أنبوب اختبار صغير( إبندروف).

3. خذ 3 أنابيب اختبار صغيرة (إبندروف) و رقمها(1،2،3).

4. تأكد من أن لديك الأشياء التالية:-

- أنابيب اختبار صغيره ( إبندروف).

- ماصة مخبرية (0.5-10) ميكروليتر مع رؤوسها المناسبة.

- أنبوبان يحتوي أحداهما على بلازميد (أ) والثاني على بلازميد ب.

- أنبوب اختبار فيه محلول منظم مركز عشرة أضعاف (X10).



طريقة العمل:-



1- قم بإضافة 5 ميكروليتر من بلازميد ا إلى أنبوب الاختبار الأول.

2- قم بإضافة 3 ميكروليتر من بلازميد ب إلى أنبوب الاختبار الثاني.

3- قم بإضافة2 ميكروليتر من سلم الDNA إلى أنبوب الاختبار الثالث ( أنبوب الاختبار الذي يحتوي على سلم الDNA موجود على طاولة الأستاذ).

4- ضع 2 ميكروليتر من المحلول المنظم المركز إلى الأنبوب الأول و الثاني.

5- ضع 1 ميكر ليتر من إنزيم القطع ( EcoRI) الى كل من ألانابيب الاول والثاني ( أنزيم القطع موجود أيضا على طاولة الأستاذ في وعاء ثلجي ).

6- قم بإضافة مياه مقطرة إلى أنبوب الاختبار الأول و أنبوب الاختبار الثاني حتى يصل إلى 20 ميكروليتر.

7- ضع الأنبوب الأول والثاني في الحوض المائي على درجه حرارة 37 مئوية لمده 30 دقيقه.



الرقم
البلازميد ميكروليتر
المحلول المنظم المركز
أنزيم القطع
سلمDNA
الماء المقطر

ميكروليتر

1






2






3
























تعليمات تسيير الجل :-



1- لكي نوقف التفاعل الأنزيمي نقوم بإضافة 3 ميكروليتر إلى الأنابيب الثلاثة من المحلول المنظم الأزرق ( الأنبوب معلم ب10X) هذا المحلول المنظم يحتوي على مواد كيماوية تقوم بإعطاء اللون الأزرق للخليط لذلك يمكننا أن نتتبع حركة تقدم الDNA على الجل، ويحتوي المحلول المنظم أيضا على الجليسيرول، المواد الكيماوية التي تثبت ال DNA داخل الجل وتمنعه من الخروج منه.



2- قم بإزالة المشط من الجل ( اطلب مساعدة المعلم )

3- ضع الجل في الأداة الخاصة به وتأكد بان الضوء الأحمر مضاء

4- قم بضغط الزر الموجود على الجهة اليمنى(تأكد بان الضوء الآخر مضاء)



* انتظر بالضبط دقيقتان !

5 - اضغط على الزر مرة أخرى وتأكد أن الضوء الحمر مضاء ،ثم قم بوضع عينتك في كل بئر (عينه واحده بكل بئر)

6- اضغط على الزر مرة أخرى وتأكد إن الضوء الأحمر مضاء، انتظر 30 دقيقة حتى يصل اللون الأزرق إلى نهاية الجل (الوقت بالضبط سوف يحدد بتقدم اللون الأزرق على الجل)

7- عندما يصل ال DNA إلى النهاية , اضغط مره أخرى على الزر الموجود بالجهة اليمنى(اللون الأحمر يجب إن يكون مضاء) ثم قم بإزاله الجل

8- ضع الجل تحت صندوق الضوء فوق البنفسجي ، ثم قم بسحب صوره بواسطة الكمرة الرقمية (الديجيتال) .

مهم:-

الضوء فوق البنفسجي مؤذي للعينين، فقط الأستاذ ممكن إن يضيء الضوء الفوق بنفسجي ، ويجب أن يفعل ذلك فقط بعد إن يضع القمع الأسود فوق الجل.



الملخص : النتائج والمناقشة .

* اكتب عدد قطع ال DNA الواضحة في كل مجرى عل الجل.

* اكتب طول كل قطعه ( استعمل 1 كيلو قاعدة سلم كمرجع)

* اكتب أي أنبوب اختبار يحتوي على بلازميتد أو أي أنبوب اختبار يحتوي على بلازميد ب ,أي بلازميد يحتوي على الجين السري وأي بلازميد هو الأصلي.

* قارن نتائجك مع نتائج مجموعات أخرى،هل حصل الجميع على نفس النتائج؟ إذا لم يحصلوا على نفس النتيجة ، قارن نتائجك مع أستاذك وابحث عن سبب حصول الاختلاف .



" متدرب التقانة الحيوية "



الطريقة الأولى للتمييز بين البلازميدات هي تسييرهم على جل الاجاروز والتعرف عليهم حسب احجامهم .

الطريقة الثانية للتميز بين البلازميدات هي عن طريق تأثيرات مختلفة على بكتيريا الايكولاي ( Ecoli) بعد نقل البلازميد إليها .





تعريف :-

التحويل ( Transformation ): هي طريقة لإدخال DNAالغريب إلى خلية أو إلى كائن حي وكنتيجة لذلك فان الخلية أو الكائن الحي سوف يحمل صفات جبنيه جديدة .

سؤال:-

أي صفه يمكن إن تكتسب من البلازميد الأصلي؟ أي صفه يمكن إن تكتسب من البلازميد الذي يحتوي على الجين السري؟





ملاحظة : إن إحدى الطرق الشائعة في التقانه الحيويه لاختيار البكتيريا المعدلة جينيا هي استخدام الاختبار الأزرق/ الأبيض . كلتا البلازميدات تحتوي على الجين LacZالذي ينتج أنزيم BGAL. المادة المتفاعله للBGAL عديمة اللون ولكن بوجود انزيم BGAL تتحول الى اللون الازرق لذلك كل بكتيريا تحولت جينيا سوف تتحول إلى اللون الأزرق بوجود X GAL و سوف تلاحظ مستعمرات زرقاء للبكتيريا .



سؤال :-

انظر إلى خريطة البلازميد التي تحتوي على الجين السري ، في رأيك البكتيريا التي ادخل إليها الجين السري سوف تقوم بعمل مستعمرات بيضاء أم زرقاء ؟ وضح ذلك مع إعطاء أدق التفاصيل .



كيف يمكن إن تستخدم الاختبار الأبيض / الأزرق لمعرفه أي أنبوب اختبار يحتوي على البلازميد الأصلي وأي أنبوب يحتوي على الجين السري ؟



مهم :-

أثناء سير التجربة , هنالك عدة خطوات تجري بسرعة وبدقه حتى تنتج عمليه التحول(transformation) الرجاء قراءه التعليمات بدقه، ثم تأكد بان جميع المعدات التي تحتاجها موجودة قبل البدأ بالتجربة .

ابدأ التجربة بعد إن يكون كل شيء واضح لك، ولديك كل شيء مطلوب.



التحضير

تأكد إن درجه حرارة الحوض المائي هي 37 درجه مئوية ، إذا لم تكن كذلك ،قم بتعديل درجه الحرارة و انتظر حتى تثبت.



المواد والمعدات :-

1- وعاء مليء بالثلج المكسر .

2- ماصة مخبريه (0.5-20 ميكرو ليتر ) مع رؤوسها المناسبة .

3- ماصة مخبرية (20-200 ميكروليتر ) مع رؤوسها المناسبة .

4- ماصة مخبرية (200-1000 ميكروليتر ) مع رؤوسها المناسبة .

5- 7 أطباق اجار (LB-agar) ثلاثة تحتوي على مضاد حيوي امبسيلين ( ampicillin)) وأربعة أطباق تحتوي على امبسليين + X GAL ( هذه الأطباق مغطاة بطبقة من X GAL ).

6- أنبوب اختبار فيه 3 مل من لوريا بروث (LB) +امبسيلين (( ampicillin .

7- ثلاثة أنابيب اختبار صغيرة ( ابندروف ). كل أنبوب اختبار يحتوي على 50 ميكرليتر من بكتيريا الايكولاي المختضة) ( competent (وهما بكتيريا قد عولجت بطريقة معينة لكي تسمح للبلازميد بالدخول إليها .

8- أنبوب اختبار إبندرف يحتويان على البلازميد أ والبلازميد ب

9- ذراع زجاجية لزرع البكتيريا .

10- كحول ايثيلي .

11- موقد غار .



الطريقة :-

1. ضع أنبوب الاختبار الذي يحتوي على 3مل من بروث (LB) في الحوض المائي على درجة حرارة 37 مئوية , ثم قم بتركه .

2. ضع 3 أنابيب اختبار صغيره ( إبندروف تحتوي على البكتيريا المختضة في وعاء الثلج ورقمها (1,2,3) .

3. بعد ذوبان البكتيريا , قم بإضافة 2 ميكروليتر من البلازميدات إلى الأنابيب التي تحتوي على البكتيريا المختصة . ضع 2 ميكروليتر من بلازميد (أ) إلى أنبوب الاختبار الأول وضع 2 ميكروليتر من بلازميد (ب) إلى أنبوب الاختبار الثاني , أنبوب الاختبار رقم 3 سيكون فقط للمقارنة ( بحيث نرى ماذا سيحصل للبكتيريا التي لم يحدث لها تحول ) .

4. قم بوضع أنابيب الاختبار (1,2,3) في وعاء الثلج لمدة 30 دقيقة ( من المهم عدم تحريك الأنابيب أثناء وضعهم بالثلج ومن المهم أيضا أن نكون دقيقين في الوقت) .

5. قم بإخراج الأنابيب من الثلج وضعهم في الحوض المائي على درجة حرارة 37 مئوية لمدة 45 ثانية بالضبط .

6. قم بإخراج الأنابيب من الحوض المائي وضعهم في وعاء الثلج لمدة دقيقتين بالضبط .

7. قم بإضافة 900 ميكروليتر من وسط (LB) لكل أنبوب اختبار

8. قم بوضع أنابيب الاختبار (1,2,3 ) في الحوض المائي على درجة 37 درجة مئوية لمدة ساعة .

9. خذ طبقين من الآجر (LB) مع X GAL. ثم قم بزرع 20 ميكروليتر من البكتيريا الموجودة في أنبوب الاختبار رقم (1) على طبق وقم بزرع 100 ميكروليتر من البكتيريا على طبق الثاني ( الأستاذ يقوم بإرشادكم إلى طريقة زراعة البكتيريا ). خذ طبق من آجار LB + امبسلين (ampicillin) , ازرع 50 ميكروليتر من البكتيريا الموجودة في أنبوب الاختبار (1) على هذا الطبق .

10.خذ طبق الآجار LB مع X GAL المتبقيين , ازرع 20 ميكروليتر م البكتيرايا الموجودة في أنبوب الاختبار (2) على واحد من الأطباق وعلى الطبق الثاني قم بزراعة 100 ميكروليتر من البكتيريا الموجودة في أنبوب الاختبار الثاني أيضا . خذ طبقا إضافيا من آجار(LB) مع الامبسيلين وقم بزراعة 50 ميكرون من البكتيريا من أنبوب الاختبار رقم 2 على هذا الطبق .

11.قم بزراعة 100 ميكروليتر من البكتيريا الموجودة في أنبوب الاختبار الثالث على طبق آجار(LB) مع الامبسيلين المتبقي .

12.قم بوضع الأطباق أما في حاضنة على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة أو لمدة 48 ساعة على درجة حرارة الغرفة ,( الوقت المطلوب لنمو البكتيريا يعتمد على درجه حرارة الغرفة , لذلك اتركها فترة كافية حتى تنمو مستعمرات البكتيريا ).



الأسئلة :-

1- نسبة قليلة من البكتيريا قد تحولت ، وهي تلك البكتيريا التي اتحدت مع البلازميد . وهي القادرة على إنتاج الأنزيمات التي يحتويها البلازميد .إذن أي البكتيريا لها القدرة على النمو على الأطباق؟ وضح ذلك .

استخدم الجدول لكتابة افتراضاتك . أنواع البكتيريا هي :-

البكتيريا غير المتحولة ، البكتيريا المتحولة مع البلازميد الأصلي ، والبكتيريا المتحولة مع البلازميد الذي يحتوي على الجين السري .















طبق يحتوي على --> نوع المستعمرات :↓
آجار LB + امبسلين +X GAL
آجار LB + امبسلين

نوع البلازميد
السري
الأصلي
لا شيء
السري
الأصلي
لاشيء

ظهور المستعمرات







عدد المستعمرات







لون المستعمرات










2- في عملية التحويل هذه , البلازميد كان يحتوي على جين قام بإعطاء البكتيريا صفة لمقاومة المضادات الحيوية , ما هو السبب في ذلك ؟

3- لماذا تم استخدام بلازميد يعطي البكتيريا صفة لمقامة المضادات الحيوية مع صفة الاختيار الأزرق / والأبيض ؟

4- بعد نمو المستعمرات في الأطباق التي قمت بالزراعة عليها سجل النتائج بالجدول الموجود في الأسفل . هل تتوافق النتائج مع توقعاتك السابقة ؟



رقم الطبق
ظهور المستعمرات
عدد المستعمرات
لون المستعمرات

1




2




3




4




5




6











الخاتمة :-

متدربنا كان لديه القدرة على التعرف على نوع البلازميد في كل أنبوب اختبار والقيام بتعليمهم قبل عودة البروفيسور وذلك بفضل عملك الجيد ،انه الآن يملك بكتيريا متحولة تحمل الجين السري ،وهذه المستعمرات سوف تستخدم لإنتاج كمية كبيرة من بلازميد الجين السري ، فلنأمل انه في المرة القادمة التي يقوم فيها متدربنا بعمل أغلاط أن تكون موجود وتقوم بإنقاذه .



تجارب ونشاطات لمستوى الصف الثاني عشر الصفحة الرئيسية