طريقة ELISA

النشاط الرابع

طريقة ELISA

حفظ النشاط

معايرة الأجسام المضادة بتقدير كمي باستعمال طريقة ELISA (اختيار الطرق المناعية الأنزيمية)





طريقة ELISA (اختيار الطرق المناعية الأنزيمية) هي الطريقة التي تسمح لنا بتحديد هوية وكمية الكثير من المواد في سوائل الجسم واغشيته ، هذه الطريقة يمكن استخدامها للكشف عن الهرمونات ، الأنزيمات ، الفيروسات ، البكتيريا ، المواد السامة ، الطفيليات ، العلامات المرتبطة بالسرطان على الخلايا المستحضرات الصيدلية ..الخ .

هذه الطريقة تستخدم أيضا للكشف عن أجسام مضادة موجهه ضد كائنات دقيقة أو أجسام مضادة للمناعة الذاتية، تجرى طريقة ELISA على طبق بلاستيكي .



الكشف عن الأجسام المضادة في مصل دم : وذلك باستخدام أبار تكون موجودة ضمن طبق يحتوي على 96 بئر بلاستيكي مغطاة بمولد الضد الخاص ( البوليسترين الذي يستطيع إن يربط بشكل غير محدد بالبروتينات ). المصل يضاف إلى الآبار المغطاة بمولد الضد , الأجسام المضادة الخاصة بمولد الضد الذي يغطي الآبار التي ترتبط به ،أما بقيه الأجسام المضادة الموجودة في المصل فتزال خلال عملية غسل الآبار المتكررة . هذه العملية نوعا ما معقدة . ولكن يمكن تقسيمها إلى أربعة خطوات :-



1- طلاء الآبار : يوضع مولد الضد في الآبار الواقعة داخل الطبق وهكذا يرتبط مولد الضد على الآبار البلاستيكية ، يتم وضع كمية إضافية من مولد الضد لضمان إن جميع مواقع الربط على البئر مرتبطة بمولد الضد ، ويضاف بروتين أخرBSA زلال مصل بقري، مع مولد الضد وذلك لضمان عدم وجود موقع ربط فارغ .

2- إضافة المصل : يضاف المصل إلى كل بئر بطريقة التخفيف المتسلسل ( مثلا 1:10 ,1:20 ,1:40 , 1:80) ثم يترك في البئر الأجسام الخاصة في المصل ( الأجسام المضادة الأولية ) ترتبط مع مولد الضد المربوط على الطبق ، بعد القيام بعملية غسل الطبق تبقى الأجسام المضادة المربوطة بمولد الضد فقط في الآبار .

3- إضافة الأجسام المضادة الثانوية : الأجسام المضادة الثانوية تضاف إلى الآبار ، هذه الجسام المضادة تتعرف على منطقة FC الموجودة على الأجسام المضادة الأولية حيث ترتبط عليها ، الأجسام المضادة الثانوية يجب إن تفقد القدرة على ربط مولد الضد ، ويجب إن يكون مربوط بأنزيم ( مثل البروكسيداز ) قبل البدأ ، إن الهدف من هذا الأنزيم هو عمل تفاعل يقوم بإنتاج لون معين .

التفاعل اللوني : في هذه المرحلة يضاف إلى الآبار مادة متفاعلة خاصة بالأنزيم المربوط إلى الأجسام المضادة الثانوية ، التفاعل بين الأنزيم و المادة المتفاعلة يقوم بإحداث تغير في لون المحلول الموجود بالبئر وهذا الغير يمكن قياسه.



في هذه المرحلة يجب معرفة :-

أ‌. لماذا لا ترتبط الأجسام المضادة الثانوية بالبلاستك أو بمولد الضد ؟

ب‌. تعتمد كمية الأجسام المضادة الثانوية الموجودة في البئر على كمية الأجسام المضادة الأولية المربوطة بمولد الضد .

ج. شدة اللون تتناسب مع كمية الأجسام المضادة الأولية المربوطة بمولد الضد .

المعيار للأجسام المضادة عكس أخر تخفيف حيث إن تغير في اللون يمكن إن يكشف المعيار الحجمي الأجسام المضادة في البئر يرتفع عند ارتفاع تركيز الأجسام المضادة في المصل .



سؤال :

ما هي الفائدة من استخدام الأجسام المضادة الثانوية ؟



عند تخفيف الأجسام المضادة الاوليه فان شدة اللون تقل وعند الوصول إلى درجة التخفيف المعينة سوف يختفي اللون في التفاعل،











(النشاط المعملي)

ملاحظات الطلبة: طريقة اليسا ELISA



الهدف :

فحص معايرة الأجسام المضادة , للأجسام المضادة الخاصة (OVA) زلال بويضة الدجاجة باستعمال طريقة اليسا ELISA .



المواد المطلوبة لطلاء الآبار بمولد الضد :-

1- طبق يحتوي على 96 بئر بلاستيكي .

2- محاليل مولد الضد :-

أ‌. محلول (OVA) تركيز 50 ملغم /مل , مخفف ب (PBS)

ب‌. محلول (BSA) تركيز 50 ملغم/مل , مخفف ب (PBS)

3- محلول الاعتراض :1% BSA , مذاب ب (PBS) .

4- محلول الغسل : (PBS)



· المواد المطلوبة لعمل التخفيف المتسلسل للأجسام المضادة الأولية ولربط الأجسام المضادة الثانوية .

1- طبق يحتوي على 96 بئر مطلي بمولد الضد (BSA) & (OVA)

2- ماصة مخبرية 50-200 ميكرو ليتر مع رؤوسها الخاصة يفضل استخدام الماصة المخبرية متعددة القنوات .

3- محلول الغسل : (PBS)

4- 0.3مل من مصل أرنب تم إكسابه مناعة ضد زلال بويضة الدجاجة (OVA) مخفف بنسمة 100:1 في PBS, كمعيار ايجابي.

5- 0.3 مل من مصل أرنب لم يتم إكسابه مناعة ضد زلال بويضة لدجاجة مخفف بنسبة 100:1 في PBS كمعيار سلبي .

6- 30 مل من محلول منظم للتخفيف : 0.5 % BSA مذاب في PBS .

7- 15 مل من محلول ( أجسام مضادة ثانوية ) : أجسام مضادة مأخوذة من ماعز مضادة للفئران مربوطة بأنزيم البروكسيداز ، الأجسام المضادة يجب إن تكون نسبة التركيز فيها 2000:1 مخففة ب PBS.

8- 15 مل من محلول منظم للمادة المتفاعلة .



الطريقة :-

طلاء الآبار بمولد الضد .

12- قم بإضافة 100 ميكروليتر من محلول مولد الضد لل (OVA) في الصفوف من 1 إلى 4 ومن 9 إلى 12 .

13- اترك الآبار لمدة ساعتين بدرجة حرارة الغرفة أو لمدة 12 ساعة على درجة حرارة 4 درجات مئوية .

14- قم بإفراغ السائل الموجود بالآبار بقلب الطبق على وعاء فارغ .

15- اغسل الآبار باستعمال محلول منظم PBS ثم افرغ عليه السائل في وعاء فارغ .

16- كرر عملية الغسل 3 مرات .

17- ضع الطبق موجه وجهه إلى ورق التنشيف . ثم قم بضرب الطبق بلطف على ورق التنشيف عدة مرات حتى تزيل ما تبقى من السائل .

18- قم بإضافة 100 ميكروليتر من محلول الاعتراض ( 1% BSA مذاب في PBS (إلى كل بئر في الطبق(حتى في الصفوف 5 إلى واتركها في درجة حرارة 4 مئوية لمدة 12 ساعة , ثم قم بغسل الطبق كما هو مشروح في الخطوات من 3-5 .

19- احفظ الطبق على حرارة 4 مئوية حتى الخطوات التالية .



· إضافة التخفيف المتسلسل للأجسام المضادة الأولية .

20- افرغ محتويات الآبار وقم بالغسل كما هو موضح بالخطوات من 3-5 .

21- جفف الآبار كما هو موضح في الخطوة 6 .

22- أضف 180 ميكروليتر من محلول التخفيف إلى كل بئر في الصفوف (A12 – A1) و 100 ميكروليتر من محلول التخفيف إلى بقية الآبار ( إلى الصفوف B إلى H) انظر الشكل 2.9 .

23- أضف 20 ميكرو ليتر من مصل الأرنب الذي تم إكسابه مناعة ضد زلال بويضة الدجاج ( OVA) )إلى ستة أبار في صف ׂ(A10,A9,A6,A5,A2,A1)A , امزج جيدا ثم انقل 100 ميكروليتر إلى البئر الذ يليه حسب الترتيب:

A1--àB1 ,A2-----à B2 , A5---à B5 , A6----à B6 , A9--à B9 ,

A10--- àB10



أكمل عمل التخفيف المتسلسل إلى صف ( H10,H9, H6,H5,H2,H1 )H. ثم خذ من البئر 100 ميكرو ليتر وتخلص من هذه الكمية .



24- قم بتغير رؤوس الماصة المخبرية ثم أضف 100 ميكروليتر من مصل الأرنب الغير مكسب مناعيا إلى الآبار A3,A4,A7,A8,A11,A12 في الآبار G3,G4,G11,G12,H3,H4,H11,H12 ، قم باضافه 100 ميكروليتر من PBS مكان المصل المجفف



25 – غطي الطبق بالبارافيلم ، واتركه لمدة ساعة على درجة حرارة الغرفة .



* ارتباط الأجسام المضادة الثانوية :-

26- افرغ السائل من الآبار ثم قم بغسل الآبار ثلاث مرات بمحلول الغسيل كما هو موضح بالخطوات من 3-5 .

27- أضف 100 ميكروليتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية إلى جميع الآبار .

28- غطي الطبق بالبارافيلم احفظه لمدة ساعة على درجة حرارة الغرفة .

29- أفرغ السائل من الآبار ثم قم بغسيل جميع الآبار ثلاث مرات كما هو موضح بالخطوات من 3-5 .



بداية التفاعل اللوني :-

30- أضف 100 ميكروليتر من محلول المادة المتفاعلة إلى جميع الآبار .

31- ضع الطبق في مكان معتم لفترة 30 دقيقة .

32- اخرج الطبق من المكان المعتم ولاحظ التغير في اللون .

33- درج شدة اللون من 1الى 5 بحيث يكون 5 اشد لون ( غامق ).





الخلاصة والمناقشة .

9- في رأيك , أي طريقة يمكن استخدامها لتدريج شدة اللون بالاعتماد على محاليل مخففة من المصل ؟

10- ارسم رسما بيانيا يبين اعتماد شدة اللون على تركيز الأجسام المضادة ؟

11- ما هو الهدف من استخدام مصل الأرنب الغير مكسب مناعيا ؟ انظر إلى الشكل 2.9 , الاعتماد (3,و4.11.12) .

12- قارن نتائج الأعمدة 1و 2 مع نتائج الأعمدة 3و4 ثم قارن الأعمدة 9 و 10 مع الأعمدة 11و 12 .

13- أي وسيط ممكن إن نغيره للحصول على شدة لون أعلى للتفاعل ؟

14- هل كان هناك معيار أجسام مضادة ايجابي في مصل الأرنب الغير مكسب مناعيا ؟ إذا كان هنالك , كيف تفسر ذلك ؟

15- شدة اللون تعتمد على تركيز الأجسام المضادة الأولية أو على الأجسام المضادة الثانوية ؟