مقايس فحص البروتين

النشاط الرابع

مقايس فحص البروتين

Bivret protein assay

حفظ النشاط

ملاحظات المعلم



أهداف التجربة :-

هذا التمرين يركز على كيفية تطوير مفهومنا ومعرفتنا العملية حول استخدام جهاز مقياس الطيف ( السبكتروفوتوميتر Spectrophotometer ) . وعلى كيفية تجهيز المنحني المعياري ومعرفة القراءات المجهولة لعينات بروتين ذات تركيز مختلفة .



المقدمة :-

انظر إلى صفحات الطالب ..

الفترة الزمنية :-

( لصف يتكون من 30 طالب , العمل بشكل فريق يتكون من اثنين ).

- 120 أنبوب اختبار مع حامل انابيب الاختبار ( 8 من الأنابيب لكل فريق ).

Transfer pipette -15 ماصه مخبريه ناقلة

Micro pipette & tips - 15 ماصه مخبريه (200-1000)مكروليتر بالإضافة للرؤوس

- 4خلايا كفيت بلاستيكية و مربعه (cuvette).

- جهاز مقياس الطيف ( السبيكتروفوتو ميتر ).

( BSA lomg/ml ) محلول مهيأ من زلال مصل بقري

- كاشف البيوريت

-ماء مقطر

- شريط بلاستيكي Parafilm

-15 مقص









معلومات الطالب .



أهداف التجربة :-



المقدمة :

البروتين هو أكثر الجزيئات الحيوية الكبيرة الذي يتواجد بغزارة في كل الخلايا . البروتينات عبارة عن مركبات , والتي تحتوي على الكربون , الهيدروجين , الأكسجين , النيتروجين , وفي بعض الأوقات على الكبريت .



كل جزيء من البروتين يتكون من عدد كبير من جزيئات الأحماض الامينية , والتي ترتبط ببعضها البعض بواسطة الرابطة الببتيدية .

البروتين بحد ذاته عديم اللون لهذا من الصعب ان الكشف عن وجوده ،أسهل طريقة لحل هذه المشكلة هي صبغ البروتين بكاشف البيوريت ثم قياس كمية امتصاص كاشف البيوريت بواسطة جهاز مقياس الطيف spectrophotometer(أداة بحث نموذجية تستخدم في كل مختبرات الأحياء والكيمياء , وهذه الطريقة تتضمن قياس كثافة اللون في المحلول وربطها بالتركيز التحليلي .

كاشف البيوريت ( كبريتات النحاس في محلول قاعدي قوي ) تتفاعل مع الرابطة الببتدية وينتج اللون البنفسجي , اللون البنفسجي يشير إلى نتيجة فحص بيوريت ايجابية لوجود البروتينات (فحص نوعي) هذه الخطوة يتم استخدام جهاز الطيف لقياس كثافة اللون الناتج .( فحص كمي ) كلما كان اللون أغمق كلما كانت نسبة البروتين أكثر .

تجهيز المنحنى المعياري :_

من اجل تحديد كمية البروتين الموجودة بواسطة قراءة امتصاص جزئية يكون من الضروري إقامة منحنى معياري.



يتم تنفيذ هذه الخطوة عن طريق تحضير تفاعل البيوريت لطريقة التخفيف المتسلسل ( أنبوب 1,2,3,4,5) التخفيف المتسلسل عبارة عن مجموعة مخففه من المحاليل بحيث يتواجد الكاشف فيها بتركيز متناقضة بصورة منتظمة )

يتم استخدام قراءات الامتصاص التي تم الحصول عليها من العينات لإنشاء رسم بياني للامتصاص للدلالة على تركيز البروتين .

هذا الرسم البياني يسمى المنحنى المعياري التقديري والذي يتم استخدامه لتحويل قراءات امتصاص عينات التجربة إلى كميات بروتينيه. يجب بناء منحنى معياري جديد في كل مرة تود فيها القيام بتحديد كميات بروتين متسلسلة . يتم تصيح المعنى المعياري حسب ظروف التجربة التي أدت إلى ظهور الاختلاف ( تحضير المحلول , حساسية جهاز مقياس الطيف , درجة الحرارة , إلى أخره ).



ملاحظة هامة : أول عينة موجودة في القائمة والتي لا يتم إضافة البروتين لها هي عبارة عن البلانك (فراغ) والتي يجب استخدامها لتصفير جهاز مقياس الطيف . البلانك مفيد عندما يتواجد مواد أخرى بجانب الماده التي تحاول قياسها والتي غالبا تتداخل مع قراءات الامتصاص للمواد الكيميائية التي تعنى بها ومن انسب الطرق للتعامل مع هذه المشكلة هي منع قراءة هذه المواد بواسطة جهاز مقياس الطيف بدون إزالتها من الأنبوب المخبري

استخدام البلانك

البلانك يحتوي كل المواد ( المادة ) في الأنبوب المخبري باستثناء المادة التي تريد قياسها , حينئذ , قبل قراءة الأنابيب المخبرية , ضع أنبوب البلانك في جهاز مقياس الطيف .



رسم المنحنى البياني :-

سجل المعلومات الناتجة عن تفاعل البيوريت الخاصة بتركيز البروتين المعياري على ورق مربعات خاص , العمود الأول يحتوي على تركيز البروتين و العمود الثاني عبارة عن الامتصاص المطابق الذي تم قياسه بواسطة جهاز مقياس الطيف .



قم بإنشاء المستوى الديكارتي للنتائج الظاهرة أمامك . تركيز البروتين يجب ان يكون على المحور السيني و الامتصاص على المحور الصادي .



الخط على الرسم البياني ينسب إلى العلاقة بين تركيز البروتين وامتصاص البيوريت , استخدام هذا المنحنى المعياري لتحويل الامتصاص الذي يتم قياسه مره أخرى إلى كمية البروتين في العينة .



طريقة العمل :- من أجل إنشاء المنحنى المعياري . قم بترقيم مجموعة من انابيب الاختبار بأرقام مثل 1,2,3,4,5 . قم بإضافة كل من الماء محلول زلال المصل البقري المهيأ , بعد إضافة المحاليل لجميع انابيب الاختبار ( كما هو موصوف في الجدول التالي , أضف كاشف البيوريت) .



جدول ناقص !!!



بالإضافة إلى المنحنى المعياري قم بتحضير عينتين مختلفتين من البروتين ذات تراكيز مجهولة يشار اليهما ب A وB

B في أنبوب اختبار وكرر العملية بالنسبة لعينة A ضع 1 مل من العينة

الآن قم بإضافة كاشف البيوريت للأنبوبين اللذان يحتويان على عينات البروتين المجهولة .



ادر الأنابيب للتأكد من خلط العينات مع كاشف البيوريت بشكل كامل , فترة الانتظار قم بإدارة جهاز مقياس الطيف من اجل تحميته ، قم بتعديل الموجه إلى 550 نانوميتر و كن متأكداً بأن جهاز مقياس الطيف في وضعية الامتصاص.



بعد مرور 15 دقيقه أضف الماء المقطر إلى الكيفيت ثم ضعها في جهاز مقياس الطيف هذا الأنبوب يؤدي عمل البلانك استخدمه لجعل قيمة الامتصاص تساوي صفرا . فيما بعد ضع محتويات المحلول الأول في الكيفيت وقم بقراءة قيمة الامتصاص سجل هذه القيمة على الرسم البياني . ثم قم بقياس امتصاص جميع الأنابيب ولا تنسى ان تقيس امتصاص المواد المجهولة .



الأسئلة :-

· صف المبدأ الذي يتم فيه استخدام جهاز مقياس الطيف للكشف عن وجود البروتين ؟

جهاز مقياس الطيف يستخدم لقياس كثافة اللون الناتج عندما يتفاعل كاشف البروتين مع الرابطة الببتيديه يتم ظهور اللون البنفسجي , اللون البنفسجي يشير إلى فحص بيوريت ايجابي ليوجد البروتين، شدة اللون البنفسجي تدل إلى تركيز وجود البروتين.



· ماذا نقصد بالتخفيف المتسلسل , ولماذا يتم استخدامه ؟

التخفيف المتسلسل هو عبارة عن مجموعه مخففة من المحاليل بحيث ان الكاشف يكون متواجدا بتراكيز متناقضة بصورة منتظمة يتم استخدامه من اجل تحديد كمية البروتين المتواجدة لدينا .



· لماذا يعتبر البلانك ضروري في هذه التجربة ؟

البلانك يعتبر ضروري من اجل تصفير جهاز مقياس الطيف . وهو مفيد عندما يتواجد مواد أخرى في هذا الأنبوب المخبري بجانب المادة التي تحاول قياسها .





· ما هو الهدف من إنشاء المنحنى المعياري ؟

الهدف من المنحنى المعياري تحويل الامتصاص الذي يتم قياسه مره أخرى إلى كمية البروتين في العينة .











تجارب ونشاطات لمستوى الصف الحادي عشر

الصفحة الرئيسية